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SPF级实验小鼠质控中实验材料检测的运用

来源:原创论文网 添加时间:2021-03-25

  摘    要: 目的 探讨对SPF级实验小鼠屏障设施进行实验材料检测的可行性及应用价值。方法 收集带入屏障设施的实验材料,对非细胞样品进行细菌培养,对细胞样品用PCR法检测支原体。结果 5年共收集14 708例实验材料,其中非细胞样品13 085例,细菌平均检出率为1.99%;细胞样品1 623例,支原体平均检出率为4.81%整体上阳性检出率呈逐年下降趋势,近年来稳定在一个相对较低的水平。结论 对带入屏障设施的实验材料进行大规模持续检控切实可行,可提示研究人员加强对动物实验材料的无菌处理,可使管理者确定来自实验材料的危害程度,同时也是SPF级实验小鼠微生物感染防控的有效措施之一。

  关键词: 动物实验; 材料检控; 细菌检测; 支原体检测; 实验动物设施;

  Abstract: Objective To establish inspection methods for materials carried into barrier facilities housing specific pathogen-free(SPF) laboratory mice.Methods Experimental materials brought into a murine barrier facility were collected.Non-cellular material samples were cultured to identify whether samples harbored bacteria,and cell samples were screened for the presence or absence of mycoplasma using PCR.Results A total of 14 708 experimental materials were collected and evaluated over a 5-year period.The average positive rate for bacterial detection in 13 085 non-cellular samples was 1.99%,and the positive rate for mycoplasma in1 623 cell samples was 4.81%.Positive detection rates for bacteria and mycoplasma have gradually decreased and have remained at low levels over recent years.Conclusions It is feasible to conduct continuous large-scale inspection,monitoring,and control of experimental materials used in animal barrier facilities.Inspection processes can strengthen the confidence of researchers performing aseptic treatment with animal experimental materials and enable facility managers to evaluate risks from experimental materials.Experimental material inspection is an effective measure for microbial quality control in SPF experimental mice.

  Keyword: Animal experiments; Material inspection; Bacterial detection; Mycoplasma detection; Laboratory animal facility;

  屏障设施作为SPF级实验动物饲养繁殖和动物实验的主要场地,其日常运行的有效管理十分重要。屏障设施管理除了控制温度、湿度、光照及噪音等环境条件,最重要的目标就是将病原微生物和寄生虫等威胁动物健康的致病因子屏蔽在外[1]。屏障设施除了对标准中规定的各项参数进行控制外,还必须考虑其他因素对屏障内实验动物质量的影响,其中威胁最大的是实验过程中使用的各种各样的实验材料,尤其是那些在屏障外制备的、不允许经高压灭菌的生物活性物质和试剂。
 

SPF级实验小鼠质控中实验材料检测的运用
 

  自2013年中国科学院生物化学与细胞生物学研究所(现分子细胞科学卓越创新中心)的2 400 m2动物屏障设施启用至今,设施内饲养的实验小鼠始终保持SPF级。在实际工作中,本单位重视对带入设施内实验材料的管理,进行了连续5年的大规模检控工作,共检测了一万多份实验材料样品。现将本单位实验材料检控的措施和结果整理成文,以期对动物实验设施的有效管理提供参考。

  1、 材料与方法

  1.1、 检测样品的获取

  本研究涉及的检测样品仅为2015—2019年实验人员带入本单位屏障设施的动物实验材料。根据本单位对屏障设施管理的规章制度要求,每一位实验人员在完成动物实验后将实验试剂或材料留样送检,溶液类样品体积要求尽量超过100?L。针对溶液类样品和特殊饲料等非细胞类样品,检测其是否含带细菌;针对细胞类样品,则检测其有无支原体。

  1.2 、菌落检测方法

  吸取100?L溶液类样品,涂布于直径9 cm无抗L B平皿(上海科玛嘉微生物技术有限公司);送样体积少于100?L时,使用无菌水补充体积至略超过100?L,然后吸取100?L涂布于无抗LB平皿。特殊饲料等固体样品,则取小块样品无菌操作捣碎后,使用200?L无菌水浸泡,室温稍微静置,再吸取100?L上清液涂布于无抗平皿。平皿在37℃培养箱中培养24 h以上,检查有无菌落和菌落数量等。

  1.3 、支原体检测方法

  吸取细胞类样品培养液上清1 000?L,置于1.5 m L的EP管中,不足体积则用无菌水补足至1 000?L。100℃加热EP管10 min,然后以12 000 r/min离心10 min。只移取上清液100?L至新的EP管,该上清液作为后续PCR检测的样品。上清液样品于-20℃可保存1周,于4℃只可保存1 d。

  使用PCR法检测上清液样品。PCR反应体系(共20?L):2?L待检测上清样品,10?L 2×EX Taq mix,0.5?L正向引物(序列:5'-GGGA-GCAAACAGGATTAGATACCCT-3'),0.5?L反向引物(序列:5'-TGCACCATCTGTCACTCTG-TTAACCTC-3'),7?L无菌去离子水。PCR反应条件:94℃2 min,37个循环(94℃30 s,55℃30 s,72℃20 s),72℃10 min。PCR产物使用含EB的2%琼脂糖凝胶电泳,上样量为10?L/孔。使用上海天能公司生产的Tanon凝胶成像仪对电泳胶拍照记录,支原体阳性条带在270 bp附近。

  1.4、 细菌鉴定方法

  对非细胞类实验材料进行细菌检测时,如果涂布的LB平皿出现阳性菌落,则从平皿中随机挑取菌落,用三线法划线接种到营养琼脂LB平板上,37℃继续培养24 h。再从该平皿挑取单克隆菌落,利用试剂盒(康为世纪生物技术有限公司)提取基因组D N A。以基因组D N A为模板,利用细菌通用引物进行PCR扩增,正向引物序列为5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3',反向引物序列为5'-GGTTACCTTGTTAC-GACTT-3',引物序列位于细菌16S核糖体RNA对应的D N A编码区内。P C R反应体系(共20?L):2?L样品,10?L 2×EX Taq mix,0.5?L正向引物,0.5?L反向引物,7?L无菌去离子水。PCR反应条件:94℃8 min,30个循环(94℃45 s,60℃45 s,72℃30 s),72℃5 min。PCR产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,测序结果经BLAST比对后确定细菌种类。BLAST使用的网站地址为https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。

  2、 结果

  2.1 样品收集情况

  从2015年开始,根据制定的设施管理规定,要求实验人员将带入的实验材料进行分样送检。在操作过程中,通过表格登记、传递仓监控、定期回溯有无人员漏送样品并加以提醒等措施,促使研究人员如实送检样品。送检的样品种类主要有化学和生物学试剂、麻醉剂、特殊饲料、细胞系、质粒、D N A或R N A等。5年累计收检样品14 708份,兽医实验室对所有样品进行了检测。表1为2015—2019年各种实验材料数量(包括非细胞类样品材料和细胞类样品材料)、收检样品分类和总量统计结果。从表1可以看出,随着屏障内实验小鼠饲养量和动物实验量的逐年增加,实验人员按照要求送检的样品总量也逐年递增。

  表1 2015—2019年收检样品分类和总量统计表
表1 2015—2019年收检样品分类和总量统计表

  2.2 、非细胞类样品菌落检测结果

  检测结果显示,约1/3的样品无菌落生长,多数送检样品有一定量菌落生长。经过初期的比较权衡,将单个平皿菌落总数30个作为控制标准,超过30个菌落的样品判为细菌检测不合格,并通知实验人员处理所涉实验的动物。从表2列出的统计结果可以看到,2015年刚开始实施实验材料检控时,非细胞类样品细菌检测阳性率比较高。细菌阳性的样品数量和阳性率呈逐年下降趋势,近年来处在低于1%的检出率水平。图1中的LB平皿为典型的样品细菌检测出现阳性的结果,据送样的动物实验人员反馈,该试剂没有经过除菌处理。

  2.3、 细胞类样品支原体检测结果

  检测结果见表3。在2015年送检的细胞样品中,支原体检出率高达13.5%。随着实验人员的重视,细胞样品的支原体检出率逐渐降低,2019年仅为1.52%。图2显示PCR法对5个细胞样品的支原体检测结果的电泳图,其中泳道4~7对应的4个细胞样品未检测出支原体,泳道8对应的1个细胞样品支原体阳性。

  表2 非细胞类样品细菌检测统计
表2 非细胞类样品细菌检测统计

  图1 LB平皿培养结果
表2 非细胞类样品细菌检测统计

  Figure 1 Results of a sample cultured on LB plate

  表3 细胞类样品支原体检测统计表
表3 细胞类样品支原体检测统计表

  图2 细胞样品PCR法检测支原体电泳结果
图2 细胞样品PCR法检测支原体电泳结果

  Figure 2 Results of electrophoresis of PCR products after mycoplasma detection in cell samples

  2.4 、实验材料中携带的细菌种类鉴定

  为探究实验材料带入细菌的类型,2019年选取了20份细菌检测阳性样品,对样品中含有的细菌进行了鉴定。20份样品共随机挑取了34个单克隆菌落,提取相应基因组D N A,P C R扩增后测序比对,从中鉴定出的细菌种类及数量见表4。样品携带细菌以葡萄球菌属的细菌居多;34个单克隆菌落中,12个为缓慢葡萄球菌,8个为腐生葡萄球菌。

  表4 细菌类别鉴定结果
表4 细菌类别鉴定结果

  3 、讨论

  本单位动物屏障设施现保养有13 000笼实验小鼠,至今持续运行已7年多,设施内实验小鼠质量始终符合SPF等级标准要求,这与从2015年开始进行大规模实验材料检控措施有密切关系。本单位规定研究人员向屏障内传递实验材料后,必须在屏障内将样品分装备检,同时提供课题组、实验人员姓名、样品名称、送检日期等信息。当细菌检测阳性或细胞支原体检测阳性时,兽医实验室会通知研究人员对实验材料制备过程进行整改,接触过阳性实验材料的小鼠须移出屏障设施。如果同一实验人员带入的实验材料在1年内累计出现3次阳性检测结果,则该实验人员不能在动物屏障设施内继续开展实验。该措施实行5年来,检测的样品总量逐年增多,但细菌和支原体阳性的样品数量和阳性率均呈逐年下降趋势,说明对带入动物实验屏障设施内实验材料的检控措施有助于降低实验材料中微生物污染风险。

  在做细胞培养时,实验人员会时刻注意无菌操作,但在做动物实验时往往疏于对材料的除菌处理,容易出现细菌或支原体污染。通过规则制定和配套检控措施,能使实验人员意识到控制实验材料中微生物的重要性并加以重视,可有效降低实验动物被污染的概率。一般实验材料可以通过高温消毒或滤膜过滤处理,一些不耐高温高压的材料可通过辐照除菌。实践中,须督促实验人员每次送检带入的实验材料样品。收到样品后须及时检测,如不能及时检测,需将样品放置4℃冰箱保藏,但不宜超过1 d,以防样品中细菌传代增量。

  支原体是清洁级实验小鼠也必须排除的病原体,支原体的感染会严重影响动物健康和实验数据[2]。支原体污染是细胞培养中经常遇到的难题,本设施要求实验人员对其细胞培养液进行自检,支原体阴性的细胞方可带入屏障设施。一旦发现有支原体阳性材料做过的动物实验,相关小鼠须移出屏障设施。考虑到动物实验的连续性,本单位在实践中设有一个小型设施,用于接纳可能被污染的实验动物,避免造成支原体在控制严格的大型设施内传播。这样可以降低出现阳性结果后对实验的影响,让大部分实验人员能够做到切实配合送检,既能保护大型屏障设施内的动物,也不会引起动物实验人员的抵触。另外,当细胞出现支原体污染,实验人员往往会使用一些抗支原体的药物加在培养液中进行控制,经过一段时间的药物使用,细胞中的支原体会大幅减少,但是这样的细胞系往往在停药一段时间后又能被检测到支原体。

  为了探究收检的实验材料所携带的细菌类别,本单位通过测序鉴定到12种细菌。其中链球菌是SPF级实验小鼠需排除的微生物,其余11种细菌未列入检测排除项。这11种细菌中,也有一些可影响人类或实验动物健康,应加以关注。比如检出次数最多的缓慢葡萄球菌曾被认为不具有致病性,但越来越多的资料表明它是人类或许多动物不可忽视的致病菌,对于免疫力低下的人群或动物可导致严重的后果,并能引起实验小鼠的慢性死亡[3];木糖葡萄球菌广泛分散于自然界,以往认为是非致病菌,但此菌引起的感染时有报道[4];产酸克雷伯菌虽未像肺炎克雷伯菌那样须在SPF级实验小鼠中排除,但该菌同样是重要的条件致病菌,主要寄生在人和动物的呼吸道和肠道,而实验小鼠也对该菌易感[5]。由此可见实验材料中携带微生物的种类非常多样,因此一定要预先无菌处理,将其对实验小鼠的危害降到最低。后续本单位将继续检控实验材料,当出现阳性结果时,进一步探究不同实验材料中容易携带的微生物种类,以便进一步探讨其对实验动物健康可能产生的影响。

  总之,用于动物实验的实验材料都将与实验动物直接接触,其携带微生物的污染势必影响实验动物的健康,进而影响动物实验数据的可靠性,还可能造成动物发病,并在屏障设施内传播,所以对动物实验材料进行检控也就显得必要和重要。本单位持续多年对实验材料检控的做法,有效保障了S P F级实验小鼠质量和设施安全,这一经验对类似动物实验屏障设施的运行管理具有参考意义。

  参考文献

  [1]李学勇.实验动物设施运行管理指南[M].北京:科学出版社, 2008:20-27.
  [2] PERCY D H, BARTHOLD S W. Pathology of laboratory rodents and rabbits[M]. 3rd ed. Ames, Iowa, USA:Blackwell Publishing Professional, 2007:325. DOI:10.1002/9780470344613.
  [3]盛相鹏,杜崇涛,许会会,等.仓鼠源缓慢葡萄球菌的分离鉴定及生物学特性研究[J].动物医学进展, 2010, 31(7):30-35. DOI:10.3969/j.issn.1007-5038.2010.07.007.
  [4]车惠琴,韩敏娣. 19株木糖葡萄球菌的生物学特性和鉴定[J].临床检验杂志, 2001, 19(4):226.
  [5] FOREMAN O, KAVIRAYANI A M, GRIFFEY S M, et al. Opportunistic bacterial infections in breeding colonies of the NSG mouse strain[J]. Vet Pathol, 2011, 48(2):495-499. DOI:10.1177/03009858282.

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