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冬季泉水中趋磁细菌的分布研究

来源:原创论文网 添加时间:2020-05-19

  摘    要: 为探究济南冬季泉水水系中细菌的生态分布、未培养趋磁细菌及其磁小体形态的多样性,选择济南市泉水源头、护城河及泉水汇集的大明湖等8处不同位点,于2018年1月13日收集水底表层泥样,富集环境中趋磁细菌,提取样品总DNA,进行16S r DNA高通量测序及生物信息学分析,并利用透射电子显微镜观察和统计趋磁细菌及磁小体的形态,揭示济南泉水水系中趋磁细菌的分布特征。结果表明,济南冬季泉水水系中趋磁细菌分布明显不均,泉水源头处未检测到趋磁细菌;黑虎泉下游护城河中发现了少量单链趋磁球菌,基因序列表明为新种,暂定为η-变形菌纲(Candidatus Etaproteobacteria)的一个菌株;众泉汇集的大明湖中趋磁细菌种类最多,且细菌和磁小体形态多样性复杂。微生物多样性分析发现,冬季泉水水系中细菌种类主要是变形菌门(Proteobacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi),三者总丰度均占细菌总量的65%以上,具有磁细菌生长所需的群落环境。本研究可为深入研究未培养趋磁细菌的全基因组及可培养条件等提供素材与线索。

  关键词: 济南泉水; 冬季; 趋磁细菌; 磁小体; 暂定η-变形菌纲; 16S rRNA; 微生物多样性;

  Abstract: In order to explore the ecological distribution of bacteria,the diversity of uncultured magnetotactic bacteria( MTB) and their magnetosome morphology in Jinan spring water system in winter,the water sludge samples were collected from 8 sites in the fountainhead,mead stream Hucheng River and downstream Daming Lake on January 13,2018. The MTB cells were gathered from the sludge samples and used to extract the genome DNA for high-throughput sequencing and bioinformatics analysis. The morphology of MTB and magnetosome were observed by transmission electron microscope,and the distribution features of MTB in Jinan spring water in winter were revaled. The results showed that the distribution of MTB in Jinan spring water system was obviously uneven. No MTB was detected at the fountainheads. A small amount of single-stranded magnetococci was found in the downstream of Heihu Spring,which is a strain of Candidatus Etaproteobacteria.Daming Lake had the most diverse types of magnetotactic bacteria,and the morphology of bacteria and magnetosomes was diverse. Microbial diversity analysis showed that the types of bacteria in the spring water system in winter were mainly Proteobacteria,Cyanobacteria and Chloroflexi,whose abundance was more than 65%. The results in this article would provide materials and clues for the further researches of the whole genome and cultured conditions.

  Keyword: Jinan spring water; Magnetotactic bacteria; Magnetosome; Candidatus Etaproteobacteria; 16S rDNA; Microbial diversity;

  趋磁细菌是一类可沿地球磁场运动的微生物总称,广泛存在于海洋和湖泊中。其独特之处在于胞内能够合成由生物膜包被的纳米级磁性颗粒———磁小体(magnetosome),目前发现的磁小体主要成分为磁铁矿或胶黄铁矿[1]。相对于人工合成的磁性颗粒,磁小体具有众多优点,如化学组分纯度高、质地均一、热损耗高等,具有广阔的应用前景。然而,趋磁细菌生长条件苛刻,实验室条件下仅有少量趋磁细菌(如AMB-1)能被纯培养[2],这给其深入研究带来较大困难。
 

冬季泉水中趋磁细菌的分布研究
 

  快速发展的宏基因组技术为未培养微生物的研究开拓了全新的方法,人们可通过对环境中微生物遗传物质的分析探究趋磁细菌种群的种类、分布以及功能基因簇的起源与系统发育等。由于环境条件可能作为重要的进化压力,在趋磁细菌长期演化过程中扮演重要角色,因此认识不同季节不同天然条件下趋磁细菌的分布就引起人们广泛的兴趣。前人研究揭示,在河流、湖泊、海洋等常见水体及以盐碱湖和热泉为代表的极端环境中趋磁细菌都具有复杂的生物多样性[1,3,4,5,6],且种类的分布与环境因子体现出明显相关性[7,8]。目前还未见有关趋磁细菌在冬季泉水这种寡营养水体环境中的生物多样性研究。本试验即以冬季寡营养的济南天然泉水水系为研究对象,分析趋磁细菌的分布以及细菌和磁小体的形态多样性,揭示不同区域泉水的微生物多样性,为进一步研究趋磁细菌与环境微生物群落之间的关系奠定基础。

  1、 材料与方法

  1.1、 样品采集

  于2018年1月13日采集大明湖(DMH)、五龙潭(WLT)、黑虎泉(HHQ)和珍珠泉(ZZQ)八个位点(表1)的水底表层沉积物,按照水∶环境沉积物体积比为1∶2的比例保存在白色不透明的500m L采样瓶中,实验室中室温(约25℃)避光保存。每个点取样5瓶。采样点信息见表1。

  表1 冬季济南泉水水系的采样点
表1 冬季济南泉水水系的采样点

  1.2、 趋磁细菌的收集

  待趋磁细菌环境沉积物样品在实验室中放置3~4周后,使用悬滴法[9]在奥林巴斯BX51显微镜(奥林巴斯公司,日本东京)下检查样品中的趋磁细菌。尽管沉积物样品采集自相似的泉水环境,但仅从黑虎泉下游护城河及大明湖采集的样品中发现趋磁细菌,形貌主要为杆状和球状;使用自制磁分离器分离出趋磁细菌细胞[10],用于后续透射电子显微学分析和分子生物学实验。

  1.3、 透射电子显微镜观察及分析

  将收集到的趋磁细菌细胞离心后去上清,加入1 m L Milli-Q水重悬后,重复洗涤三次后浓缩至100μL。取约1μL趋磁细菌细胞悬浊液滴到铜网上,待完全干燥后使用JEM2100显微镜(JE-OL,日本东京)进行透射电子显微学分析。

  1.4、 基因组DNA提取及16S rRNA序列PCR扩增

  用土壤DNA提取试剂盒(Omega,美国)提取泉水表层泥样中的总基因组DNA,基因组DNA的纯度和浓度用NanoDrop-ND-2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA,USA)测定,并且OD260/280在1.8~2.0之间。使用条码融合探针(27F:5'-AGAGTTTGATCCTG-GCTCAG-3'和533R:5'-TTACCGCGGCTGCTG-GCAC-3')覆盖V1—V3高变区扩增16S r DNA基因。将PCR产物稀释为相同浓度,然后使用焦磷酸测序仪进行测序。16S r DNA扩增上下游引物分别为27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')[11]。扩增条件为:95℃2 min,随后95°C变性30 s,55℃复性30 s,72℃延伸90 s,进行25个循环,最后72℃延伸5 min。为了纯化PCR产物,扩增后的16S r DNA序列使用0.8%琼脂糖凝胶电泳法进行分离并使用E.Z.N.A.胶回收试剂盒进行纯化。纯化产物用T载体连接试剂盒(Ta KaRa,日本)连接到pMD19-T载体上,然后转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞(天根,中国)中。随机挑选一百个克隆,使用与质粒结合的引物M13-47(5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3')和RV-M(5'-GAGCGGATAACAATTTCA-CACAGG-3')扩增进行Sanger测序。并使用QI-IME软件来控制数据质量,包括进行长度的筛选和低质量序列的过滤,舍弃长度不足1 200 bp的序列。

  1.5、 趋磁细菌系统发育树的构建

  使用Clustal W算法将长度和质量达标的16S r DNA序列进行对齐和排序处理,处理结果再利用MEGA 7.0软件[12],通过临位相连法[13]构建系统发育进化树,引导程序重复计算一千次。

  1.6、 高通量测序及生物信息学分析

  将测序得到的全部序列,按照97%相似性对不重复序列进行OTU聚类。聚类过程中去掉质量不佳以及嵌合体的序列,得到具有代表性的OTU序列。为了得到每个OTU所对应的物种分类信息,参照16S r DNA序列参考数据库(http://www.arb-silva.de)采用贝叶斯算法对OTU的序列进行分类学分析,统计各个水平下微生物群落的组成。Chao1和其它指数的计算使用QIIME。

  2、 结果与分析

  2.1、 趋磁细菌多样性分析

  利用本实验室已经建立的磁分离方法富集济南不同泉水样品中的趋磁细菌,结果发现大明湖的泥样中都存在趋磁细菌,并且趋磁细菌种类多样;而泉眼处(珍珠泉、五龙潭、黑虎泉)及多数河道(珍珠泉、五龙潭)未分离到趋磁细菌,仅黑虎泉下游护城河河道表层泥样存在少量趋磁细菌。利用磁分离富集获得样品进入基因测序及系统发育树分析,共获得7条趋磁细菌序列,其中五条分布在暂定η-变形菌纲(Candidatus Etaproteobacteria)中,两条分布在硝化螺菌门中(图1)。这7个OTU的序列均已提交到NCBI数据库中,序列号如表2所示。其中OTU1为未发表过的全新序列,代表了暂定η-变形菌纲(Candidatus Etaproteobacteria)的一个新的种(MT140292)。其余序列均有类似的序列已经被发表,克隆OTU2与克隆TB24的16S r DNA序列相似度为98%[14];克隆OTU3、OTU4与已发表克隆OTU29的16S r D-NA序列相似度分别为99%、98%,OTU3和OTU4相似度为98%[15],可能来自同一的菌株;克隆OTU6与克隆MY3-11A的16S r DNA序列相似度为99%[16];克隆OTU7与已鉴定趋磁细菌菌株MYR-1相似度为99%[17]。其中OTU1为优势菌株,在大明湖和黑虎泉下游护城河中都有广泛分布,其余菌株只在大明湖泥样中有分布。

  表2 获得的16S r DNA序列
表2 获得的16S r DNA序列

  注:所有序列均已提交NCBI数据库。

  2.2、 大明湖泥样的趋磁细菌形态分析

  进一步通过透射电子显微镜分析获得的未培养趋磁细菌及磁小体的分布与形态。图2展示观察到的7株不同趋磁细菌,其中球菌6株、杆菌1株。济南泉水水系中磁小体在菌体中排列方式多样,有单链、双链、多链、束状和分散排列等形式,这些排列方式与已报道的方式基本一致[4,15];而磁小体形态主要表现为长方体和子弹头状,也展示了较多的形态。其中在大明湖和黑虎泉下游护城河优势菌株OTU1的磁小体为单链(图2E1,图2E2),说明磁小体链条数较少,其能量代谢负担要小,因而易形成优势种群。

  此外,我们还统计了不同趋磁细菌中磁小体的形状分布,发现单链球菌、四链球菌的磁小体形状因子(磁小体宽度/磁小体长度)均集中分布在0.7~0.8之间,但单链球菌的磁小体颗粒更大一些,分布在20~150 nm之间,而四链球菌的磁小体颗粒要小一些,分布在20~110 nm之间。双链球菌磁小体形状因子分布范围较大,在0.5~0.9之间,磁小体颗粒也更大一些,最大165 nm左右。杆菌合成子弹头形磁小体,当磁小体长度小于40 nm时形状因子分布在0.8左右,而当磁小体长度大于40 nm后形状因子随着长度的增加逐渐减小,磁小体最大165 nm左右,与双链球菌的相当(图3)。

  图1 基于16S r DNA序列构建的冬季济南泉水水系中趋磁细菌的系统发育树
图1 基于16S r DNA序列构建的冬季济南泉水水系中趋磁细菌的系统发育树

  括号内为菌株的16S rRNA基因序列在GenBank中的登录号,其中加粗的序列为本研究中发现的序列;进化树节点上的数据为Bootstrap值;标尺0.02代表序列间的分歧度。

  图2 大明湖和黑虎泉趋磁细菌和磁小体的透射电子显微照片
图2 大明湖和黑虎泉趋磁细菌和磁小体的透射电子显微照片

  A—G,代表富集检测到的7种不同的趋磁细菌及其磁小体的形态。数字1,细菌和磁小体链整体形态;数字2,磁小体形态。

  图3 黑虎泉和大明湖水体中收集到的趋磁细菌磁小体电子显微学分析
图3 黑虎泉和大明湖水体中收集到的趋磁细菌磁小体电子显微学分析

  2.3 、不同泉水表层泥样微生物种群组成分析

  为进一步探究济南冬季泉水水系中微生物区系分布,利用高通量测序法分析了四处泉水水系中微生物的多样性。发现8个样本的Sobs稀释曲线趋于平缓(图4A),表明测序数量合理;Shannon稀释曲线趋于平坦(图4B),表明测序数据量充足,可以反映样本中微生物的多样性。

  济南泉水水系中主要细菌群落是变形菌门(Proteobacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi),三者总丰度均占细菌总量的65%以上(图4C)。其中,五龙潭样品中蓝细菌门(Cyanobacteria)丰度最高,占总细菌丰度的40%。黑虎泉与大明湖中蓝细菌门(Cyanobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)丰度相似,均占细菌总丰度的25%~30%。珍珠泉水系微生物丰度与其它样品差距较大,其丰度最高细菌为变形菌门(Proteobacteria),其次为绿弯菌门(Chloroflexi),而蓝细菌门(Cyanobacteria)含量相对较少。由于这次从冬季泉水中分离获得的趋磁细菌主要是变形菌门(图1),而趋磁细菌要形成相关竞争,需要有一定的氧气浓度,因此可进行光合作用的合适比例的蓝细菌门细菌可能是其形成相对优势菌的菌落基础(图4D)。

  图4 冬季济南4处泉水水系微生物群落测序分析
图4 冬季济南4处泉水水系微生物群落测序分析

  A.Sobs稀释曲线;B.Shannon稀释曲线;C.样本与微生物物种的共线性关系;D.相关样本微生物种类丰度。

  3 、讨论与结论

  自然界中趋磁细菌资源丰富、种类繁多,在地球生物化学元素循环尤其是铁和硫的代谢中发挥重要作用。本研究通过比较济南市冬季不同泉群水系中趋磁细菌分布,发现泉水的源头(黑虎泉、珍珠泉、五龙潭)处并没有检测到趋磁细菌,而在黑虎泉下游护城河中发现了少量趋磁细菌,为暂定η-变形菌纲(Candidatus Etaproteobacteria)的一个OTU1,多为单链趋磁细菌;大明湖中趋磁细菌种类与数据最为丰富,无论磁小体链的条数、形态还是单个磁小体的形态,都具有明显的多样性。

  暂定η-变形菌纲(Candidatus Etaproteobacteria)是最近才确立的一个新的趋磁细菌分类单元,代表性的纯培养微生物均为趋磁球菌,结合系统发育树和透射电子显微镜照片,我们初步推测观察到的球菌可能属于暂定η-变形菌纲(Candidatus Etaproteobacteria)。除球菌外,大明湖中还发现了1株杆菌,该趋磁细菌可以形成多束磁小体链,磁小体链呈子弹头状,而这些特征均是硝化螺菌门趋磁细菌的典型特点,因此我们推测该细菌可能属于硝化螺菌门。值得注意的是,OTU1是一个从未发表过的全新序列,可能代表了暂定η-变形菌纲(Candidatus Etaproteobacteria)的一个新种。

  进一步分析磁小体大小和形态发现,单链球菌、四链球菌的磁小体大小和形状因子均比较集中,因此,这些单链球菌和四链球菌的细胞极有可能来自同一个单链球菌和同一个四链球菌菌株。而双链球菌的磁小体形状因子分布范围较大,这意味着大明湖中的双链球菌可能来自不同的菌株。子弹头状磁小体在长度小于40 nm时形状因子分布在0.8左右,在大于40 nm后随着长度的增加形状因子逐渐减小,这与前人研究中提出的MYR-1子弹头型磁小体的生长模式接近[18]。同时,我们也获得了与MYR-1相似度极高的序列(相似度>99%),因此推测大明湖中合成子弹头型磁小体的趋磁杆菌很有可能与MYR-1为同一菌株。

  本试验的8个取样点中,我们仅从大明湖的2个点、黑虎泉下游的1个点中分离到趋磁细菌,但这些取样点的主要细菌种类相同,仅丰度有差异,推测可能是环境中微生物群落的变化影响了趋磁细菌的分布。下一步,我们将深入探索不同泉水样品的化学元素组成和差异,以及不同季节、不同取样深度等泉水中微生物群落和趋磁细菌的差异,并进一步深度测序宏基因组,找出泉水中趋磁细菌分布与环境因子的内在关联性。

  综上所述,济南冬季泉水水系中趋磁细菌分布差异较大,仅在黑虎泉下游护城河和大明湖中发现趋磁细菌,其中黑虎泉下游护城河中的趋磁细菌量少且仅为η-变形菌纲(Candidatus Etaproteobacteria)的一个OTU1,而大明湖中趋磁细菌种类繁多且细菌和磁小体形态多样性。推测趋磁细菌的分布与环境因子有一定相关性,但还需要进一步深度分析。

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