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根瘤菌的种类、生物学鉴定及应用探究

来源:原创论文网 添加时间:2020-06-20

  摘    要: 豆科植物(legumines)作为重要的粮食及经济作物,一直以来被广受重视。根瘤菌(Rhizbium)是一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性杆菌,可与豆科植物形成共生固氮体系,不仅可以提高植物的产量而且对周边生态环境无影响。根瘤菌与豆科植物的共生体系是生物固氮效率最高的,占生物固氮总量的65%以上。深入研究这种共生固氮体系对中国农业的可持续发展具有重要意义。近年来,越来越多的学者参与到根瘤菌的分类、鉴定以及应用技术的研究。本文主要从根瘤菌的分类、形态水平、生理生化水平、细胞组分、核酸分子水平的鉴定和根瘤菌的应用等方面进行了综述,为根瘤菌的实际应用提供参考依据。

  关键词: 豆科植物; 根瘤菌; 分类; 鉴定; 应用;

  Abstract: Leguminosae, as important food and cash crops, have been widely valued. Rhizobia are gramnegative bacilli which are ubiquitous in soil, and can form symbiotic nitrogen fixation system with legume plants. Rhizobium can not only increase the yield of plants, but also have no effect on the surrounding ecological environment. The symbiotic system of Rhizobium and leguminous plants has the highest biological nitrogen fixation efficiency, accounting for more than 65% of the total biological nitrogen fixation. The in-depth study of the symbiotic nitrogen fixation system is beneficial to the sustainable development of China's agriculture. In recent years, more and more scholars have been involved in the classification, identification and application of Rhizobium. In this paper, the classification, morphological level, physiological and biochemical level, cell components, nucleic acid molecular level identification and application of Rhizobium are reviewed,which could provide references for the practical application of Rhizobium.

  Keyword: Leguminosae; Rhizobium; taxonomy; identification; application;

  0、 引言

  豆科植物在全球拥有广大的种植面积,其富含蛋白质、碳水化合物、纤维、矿物质和维生素等,具有较高的经济价值[1]。豆科植物可与根瘤菌形成共生关系,且该共生体系的固氮作用一直是众多科研人员研究的热点[2]。根瘤菌是一类分布广泛的革兰氏阴性杆状细菌,主要属于α-根瘤菌[3],可分为固氮根瘤菌属(Azorhizobium)、短根瘤菌属(Bradyrhizobium)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、根瘤菌属(Rhizbium)和中华根瘤菌属(Sinorhizobium)[4]。据报道,还有其他的α-根瘤菌属,如分枝杆菌属(Methylobacterium)、枯草杆菌属(Ochrobactrum)、氨基杆菌属(Aminobacter)、微小病毒属(Microvirga)和叶状杆菌属(Phyllobacterium)。此外,β-根瘤菌如伯克霍尔德菌属(Burkholderia)和贪铜菌属(Cupriavidus)也可以和豆科植物形成共生关系[5]。
 

根瘤菌的种类、生物学鉴定及应用探究
 

  在适宜的条件下,根瘤菌能侵染豆科植物根部或茎部并与之形成共生结瘤固氮,且以共生体的形式将空气中游离态氮转化为植物可吸收利用的化合态氮。根瘤菌与豆科植物的共生体系是生物固氮效率最高的,占生物固氮总量的65%以上,对中国农业的发展具有重要意义[6]。大量的实践证明,在豆科植物接种根瘤菌剂后作物产量会明显提高,根瘤菌剂是化学肥料良好的替代品之一,且对周边生态环境无影响,有利于农业的可持续发展[7]。近年来,越来越多的学者参与到根瘤菌的分类、鉴定以及应用技术的研究。本文主要从根瘤菌的分类,根瘤菌的形态和习性、细胞组分及核酸水平的鉴定以及根瘤菌的应用进行综述,以期展现根瘤菌的应用前景,为根瘤菌的鉴定提供参考依据。

  1、 根瘤菌的分类

  根瘤菌的分类几经变迁,近几年来不断地增加一些新的属种。本文对《伯杰氏系统细菌学手册》发表至今根瘤菌分类的新进展进行了综述。研究表明,来自于不同豆科植物的根瘤菌存在着极大的差异。目前,根瘤菌大多属于α-和β-变形菌纲,共17个属,近100多个种。它们分别是:α-变形菌纲中的中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、分枝杆菌属(Methylobacterium)、德沃斯氏菌属(Devosia)、根瘤菌属(Rhizobium)、枯草杆菌属(Ochrobactrum)、氨基杆菌属(Aminobacter)、剑菌属(Ensifer)、伴根瘤菌属(Pararhizobiu)、申氏杆菌属(Shinella)、新根瘤菌属(Neorhizobium)、微枝形杆菌属(Microvirga)、叶瘤杆菌属(Phyllobacterium)、固氮根瘤菌属(Azorhizobium)、微小病毒属(Microvirga)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)等[8];β-变形菌纲中的伯克霍尔德菌属(Burkholderia)和贪铜菌属(Cupriavidus);γ-变形菌纲的假单胞菌属(Pseudomonas)[9]。

  2、 根瘤菌形态水平的鉴定

  根瘤菌经革兰氏染色后,镜检下呈阴性短小杆状,无芽孢,中间可能会出现未被染成红色的透明节状部分。根瘤菌菌株在YMA(酵母甘露醇琼脂)培养基上28℃培养,3~5天即可出现肉眼可见的单菌落,菌落直径一般为3~8 mm。菌落呈半透明乳白色、圆形且边缘整齐、中间略有隆起、有粘液、较粘稠。根瘤菌在刚果红YMA培养基上,28℃培养3~7天菌落不吸色。根瘤菌在PKO(Pikovaskaia’s)培养基上,28℃培养3~7天即可出现单菌落。根瘤菌具有可以侵入豆科植物形成根瘤的特殊性质,回接实验也可以对根瘤菌进行鉴定[10]。

  王金生等[11]利用YMA培养基分离出具有优良耐旱、耐酸碱性的大豆根瘤菌112-1、113-1,且经回接实验后发现,应用根瘤菌的大豆在株高、单株粒数、百粒重上明显提高,为中国黑龙江地区大豆根瘤菌的实际应用提供理论依据。柏宇等[12]经YMA平板培养基初筛,蛭石盆栽复筛分离得到耐高氮的优良大豆根瘤菌菌株5481,并且能提高大豆苗期植株的干重和全氮量,为中国东北高氮地区根瘤菌的应用提供理论依据。吴萍等[13]分离出对微量元素(钴、铁、硼、锌等)和酸碱具有较高的耐性的AWCS13-4根瘤菌菌株,并且研究发现一定浓度的铁、钴、硼、锌对根瘤菌的生长有一定的促进作用,为根瘤菌的田间应用提供科学理论依据。徐传瑞等[14]经YMA,LB培养基纯培养,盆栽实验筛选出具有较高固氮效率的根瘤菌株ZX20和SMH12,为中国根瘤菌的小区田间应用提供事实理论依据。王金生等[15]经YMA固体平板培养基、液体培养基并采用GGE双标图对黑龙江省不同生态区的根瘤菌进行分离、鉴定、纯化,得到具有良好耐旱性根瘤菌株111-1、耐酸性较强的根瘤菌株111-2、耐碱性较强的根瘤菌株111-3,为中国黑龙江地区根瘤菌的应用提供宝贵的菌种资源。刘瑞瑞等[16]对花生根瘤菌进行采集、分离纯化得到Hbu074005根瘤菌,回接实验后发现接种Hbu074005根瘤菌的花生在果穗数,植株株高等指标上明显优于其他处理,为中国高效固氮根瘤菌在花生农业上的应用奠定理论依据。

  3、 根瘤菌生理生化水平的鉴定

  根瘤菌可在4~37℃下生长,在28℃生长最佳。氯化钠浓度生长范围为0~7.0%(w/v),在1.5%~2.0%下生长最佳。生长p H 6.0~10.0,p H 7.0时生长最佳。厌氧条件下,在LB培养基上不生长。菌株对几丁质、淀粉、明胶、酪蛋白、尿素、酪氨酸和吐温20、40、60和80的水解均为阴性[17]。在API 20NE(Analysis Products INC,Mérieux)条带中,大部分菌株对硝酸盐的还原、吲哚的生产、尿素酶活性、β-葡萄糖糖苷酶(aesculin hydrolysis)、β-半乳糖苷酶、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-甘露醇、D-麦芽糖和苹果酸的利用均显阳性。过氧化氢酶和氧化酶活性均为阳性,可利用阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇、N-乙酰氨基葡萄糖、麦芽糖、葡萄糖酸盐、癸酸、草酸、苹果酸、柠檬酸和苯乙酸。对以下基质如:糊精、N-乙酰-D-葡萄糖胺、阿多尼托、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖醇、纤维二糖、I-赤藓糖醇、D-果糖、L-岩藻糖、D-半乳糖、α-D-乳糖、乳果糖、麦芽糖、D-甘露醇、D-甘露糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、D-棉子糖、L-鼠李糖、D-山梨醇、蔗糖、D-海藻糖、木糖醇、丙酮酸甲酯、乙酸、顺乌头酸、甲酸、D-葡萄糖酸、α-酮戊二酸、奎宁酸、琥珀酸、溴代琥珀酸、L-丙氨酰-甘氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-组氨酸、L-鸟氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、γ-氨基丁酸和甘油等也呈阳性[18]。在API 20NE条带中,菌株对β-半乳糖苷酶、脲酶活性、色氨酸脱氨酶、吲哚生产和乙偶姻生产均呈阳性。在API酶测试试剂盒(bioMérieux)检测中,大部分菌株对碱性磷酸酶、酯酶(C4)、酯解脂肪酶(C8)、亮氨酸氨基肽酶、胰蛋白酶、酸性磷酸酶、α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶均呈阳性,对脂肪酶(C14)、缬氨酸氨基肽酶、胱氨酸氨基肽酶和α-糜蛋白酶均呈弱阳性。大部菌株对氨苄西林、氯霉素、卡宾西林、头孢吡、环丙沙星、头孢氨苄、庆大霉素、震颤霉素、红霉素、卡那霉素、头孢唑啉、米诺霉素、诺氟沙星、氧氟沙星、青霉素G、利福平、链霉素、复方新霉素、四环素、万古霉素、磺胺嘧啶和新霉素均敏感但对克林霉素、甲硝唑和苯唑西林有抵抗力[17]。

  4、 根瘤菌细胞组分水平的鉴定

  根瘤菌的传统鉴定技术是建立在形态学、生态学特征上。方法虽然有效,但费时费力,更难以实现自动化,随着现代生物、化学、光电技术以及仪器制造业的不断更新,根瘤菌的鉴定技术得到迅速地发展。

  气相色谱技术应用于微生物的鉴定,主要是根据不同微生物的化学组成及其代谢产物的不同,利用色谱检测技术可直接分析细菌的代谢产物,细胞中的脂肪酸、蛋白质、氨基酸等,以确定微生物的特异化学标志成分。Abel等[19]于1963年首次提出通过气相色谱技术分析脂肪酸成份鉴别微生物的设想,该设想成为鉴定微生物的一个重要依据。根据脂肪酸鉴定微生物的原理,MIDI开发了sherlock微生物鉴定系统,该系统包含了2000多种微生物信息数据。通过对微生物培养、皂化、衍生化等过程分析脂肪酸,然后与数据库中的微生物信息进行比对即可鉴定。因其鉴定的准确性高、周期短而被广泛的应用。Zhao等[18]对菌株MH17T,RD15于YMA上30℃培养2天,用sasser方法制备和分析脂肪酸甲酯并用midi-sherlock微生物鉴定系统进行根瘤菌种属的鉴定。Li等[17]采用midi(Sherock Microbial Identification System,version 6.0B)和GC(Agilent Technologies 6850)对目标菌株Y21T进行了主要脂肪酸分析并与Rhizobium subbaraonis KCTC 23614T和R.borbori LMG 23925T作比较,发现菌株Y21T属于根瘤菌属。此外,气相色谱也可根据代谢类型对微生物进行鉴定,李剑峰等[10]利用气相色谱仪(GC-7890F型)参照Zaied以乙炔还原法测定根瘤菌固氮酶的活性,分离鉴定出具有高固氮能力、溶磷、产生长素和耐酸碱能力特性有良好应用前景的快生型红豆草根瘤菌RS-1菌株,为中国根瘤菌的实际应用提供优良的菌种资源。伍惠等[7]利用YMA、LB培养基、气相色谱仪(GC4000型)等仪器分离、鉴定出大量具有高效固氮活性的优良大豆根瘤菌株,为中国长江流域、黄淮海地区、东北东南地区根瘤菌的实际应用提供理论依据。

  5、 根瘤菌核酸分子水平的鉴定

  随着科技的发展,分子生物学技术的日新月异,对微生物的鉴定技术已不再局限于普通的形态学、细胞组分和生理生化特性等鉴定上,而是深入到核酸水平。微生物的核酸序列即基因片段都是特异的,有别于其他的种或属,检测其特有的基因片段即可进行微生物的鉴定。从分子水平进行微生物的鉴定,是现代微生物学鉴定的主要手段之一,并且随着科技的发展,基因鉴定技术逐渐代替其他鉴定技术,成为现代微生物的主流鉴定手段[20]。相比于其他的鉴定方法,分子鉴定较之更具准确性、全面性、快速性。

  高亚梅等[6]对根瘤菌的共生结瘤基因nodA基因进行PCR扩增,分离出有较好结瘤效果的根瘤菌,在分子水平上实现了根瘤菌的快速鉴定,为根瘤菌的鉴定及应用提供理论依据。张怡等[21]通过对分离纯化的根瘤菌株进行表型鉴定和对nodA、nifH、16S rDNA序列进行扩增分析和系统发育分析,并经回接实验鉴定为费式中华根瘤菌,为中国河南省大豆根瘤菌提供优良菌种资源,为根瘤菌的进一步分子机制的研究奠定了基础。

  凌瑶等[22]经16S rDNA序列分析成功分离出(白)三叶草根瘤菌YA1121和CD1105,回接实验表明,白三叶草的结瘤数、株高、鲜重、干重、叶绿素和全氮含量均显着提高(P<0.5),为中国四川白三叶根瘤菌的应用研究奠定了基础。闫伟等[23]对内蒙古西部地区12份苜蓿根瘤菌进行16S rDNA鉴定,发现采集于同一地点不同植物上的菌株大多表现出近亲缘性,为根瘤菌的属内亲缘关系的研究奠定了基础。Abdelaal shamaseldin等[24]通过对目标菌株进行寡核苷酸鉴定,对nodC分析发现了一种新的根瘤菌,即Rhizobium aegyptacum sp.nov.(=USDA 7124T=LMG 29296T=CECT 9098T),为世界根瘤菌的发展提供了宝贵的菌种资源。Mwenda等[25]对肯尼亚178株菌株进行基因组DNA指纹图谱、PCR-RFLP和寡核苷酸基因序列分析,表明其中大多数菌株属于根瘤菌属。Gera等[26]从印度哈里亚洲干旱和半干旱地区收集的盆栽根瘤菌经分离、nodC扩增分析,16S rDNA限制性分析鉴定为具有广泛多样性的根瘤菌你,对开发干旱和半干旱根瘤菌的应用具重要意义。

  R?awska等[27]从匈牙利不同植物的虫瘿中分离到5株革兰氏阴性杆状无芽孢细菌,基于16S rRNA、atpd、glua、gyrb、reca等进行系统发育分析,发现5株分离菌株为根瘤菌属内的一个新种,即Rhizobium nepotum sp.nov.(=LMG 26455T=FBP 7436T)。Zhao等[18]从水稻根和根际土壤中分离出两株新型革兰氏阴性、杆状好氧菌MH17T(=ACCC 19963T=KCTC52414T)和RD15,根据其生理生化特性,基因序列等信息,鉴定为根瘤菌属的一个新种,并对其命名为rhizosphaerae sp.nov.。Yan等[28]从墨西哥希达尔戈州生长的菜豆根瘤中分离出一株革兰氏阴性有氧运动杆状细菌,命名为FH14T,基因型序列分析,提出FH14T(=HAMBI3636T=LGM 29288T)为新型根瘤菌hidalgonense sp.nov.。Wang等[29]根据16S rRNA基因序列分析,从风化岩石中分离出一株矿物风化菌,鉴定为热带根瘤菌Q34。Máthé等[30]从位于罗马尼亚的圣安娜湖火上口湖中分离出一株型的菌株SA-276T,根据其表型,化学数据和核酸分子信息,认为SA-276T(=DSM 29780T=JCM 31760T)菌株是一个新品种,命名为Rhizobium aquaticum sp.nov.。Lin等[31从台湾青椒根瘤菌中分离到一株革兰氏阴性杆状需氧细菌CC-Skc2T,基于16S rDNA、atpd和reca基因的系统发育分析显示,菌株CC-Skc2T(=BCRC 80699T=JCM 19535T)为根瘤菌属内的一个新种,命名为Rhizobium capsici sp.nov.。Li等[17]从福建省厦门市地表湖水中分离到一株革兰氏阴性好氧细菌Y21T(=MCCC 1F01210T=KCTC 42252T),根据其生物学、生理学、脂肪酸组成和16S rDNA序列数据特征,可将其视为根瘤菌属内的一个新种即Rhizobium albus sp.nov.。

  6、 根瘤菌的应用现状

  美国和巴西的大豆生产量占全球的50%以上,早在20多年前,根瘤菌的产业化就非常成熟且应用广泛,其大豆无论是产量还是质量,都远超使用工业化肥的大豆种植区。世界上最大的大豆生产国美国,单是根瘤菌肥的使用率就在50%以上,效果相当于施用619 t的氮肥。在阿根廷,根瘤菌菌肥使用率达90%以上,平均每年可节约下30亿美元的化肥。在巴西的一大豆种植实验区,接种单一根瘤菌剂即可提高大豆产量30%[7]。Fall等[32]进行回接实验,发现Legumenodulating rhizobia对盐渍土壤中的作物具有保育作用,有利于苗期的恢复。Tena等[33]对埃塞俄比亚农业生态区的48株Lentil-nodulating rhizobia进行实验后发现,实验菌株在共生效果上的差异说明接种菌剂提高扁豆产量的潜力。

  随着生命科学的迅速发展,中国的根瘤菌的相关研究也进入了快车道。索炎炎等,对豫南砂姜黑土区的花生进行根瘤菌的拌种和菌土施肥,结果花生的产量均显着提高,但根瘤菌的拌种效果稍优于菌肥的施加。段如雁等[34]对花榈木接种了不同的根瘤菌,结果花榈木的根表面积、根平均直径、生物量等均有显着的增加。刘淑霞等[35]对紫花苜蓿WL319进行中华根瘤菌SD101的接种处理,结果表明紫花苜蓿的地上生物量、叶片中叶绿素含量均显着提高。刘旭艳等[36]对多种苜蓿进行根瘤菌的接种,结果发现种植苜蓿的土壤中速效氮的含量显着增加。潘婷婷等[37]对豌豆进行根瘤菌的接种实验后发现,植物的干质量增加显着。周涛等[38]对四川主栽大豆品种‘贡选1号’进行根瘤菌S152、S150的接种实验后发现大豆的产量显着增加。李秀平等[39]对大豆进行耐酸铝根瘤菌的接种,发现酸性环境中低浓度的铝能促进结瘤,提高植物的干重及含氮量。王金华等[40]对蚕豆进行根瘤菌的回接实验,发现菌株SWFU55-1、SWFU55-2、SWFU55-3对镰孢菌XM20均有不同程度的抑制作用,能有效提高蚕豆的抗病性。

  7、 展望

  豆科植物为世界粮食及其他产业做出了重大贡献,豆科植物与根瘤菌的共生关系,也为世界农业土壤固定了足够的可再生氮源。在过去的十年里,根瘤菌的生物学取得了一些突破性的进展,甚至对非豆科植物的共生固氮和作物的生产也产生了深远的影响。随着β-根瘤菌的发现,根瘤菌的概念发生了一场革命,扩展了α-变性菌纲以外的豆科植物形成共生固氮的能力。而如何从众多分类的根瘤菌中得到具有高固氮能力、优良抗性、抗性的根瘤菌是当下根瘤菌生物学研究的热点。

  根瘤菌生物学未来的发展方向将是筛选和收集具有优良表型的菌株,并在系统生物学的指导下,将这种新的或已知的表型与基因组信息联系起来,综合考虑各种环境变量和作物生长,筛选和提高高固氮根瘤菌为植物的生长和优良耐抗性提供遗传工具,以开发出高效和可持续的农业生产系统。

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