网站地图 原创论文网,覆盖经济,法律,医学,建筑,艺术等800余专业,提供60万篇论文资料免费参考
主要服务:论文发表、论文修改服务,覆盖专业有:经济、法律、体育、建筑、土木、管理、英语、艺术、计算机、生物、通讯、社会、文学、农业、企业

海参肠道中一株乳酸菌HE04的分离分析

来源:原创论文网 添加时间:2021-09-13

  摘    要: 乳酸菌能够改善宿主微生态平衡、产生健康功效、发挥有益作用。本文从海参肠道分离到一株乳酸菌HE04。观察其细胞为杆状、革兰氏阳性,菌落乳白色较小;过氧化氢酶阴性、精氨酸产氨实验、硫化氢的产生和V-P实验均为阴性;能水解淀粉、半乳糖等糖水化合物;最终通过分子生物学鉴定该乳酸菌HE04为植物乳杆菌。

  关键词 :     海参;乳酸菌; 16S rDNA测序;

  海参自古以来被誉为“海产八珍”之一,具有滋补强身的作用,可与人参媲美[1]。乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、非病原性、革兰氏染色阳性细菌的总称[2]。乳酸菌对人体肠道功能和免疫调节带来的良好作用[3],近年来益生菌的应用领域一直在不断拓展,也正逐步得到研究者的关注[1,2,3,4]。本研究从海参肠道中的乳酸菌研究奠定基础,为应用于农产品加工,增加食品的货架期,改善因化学防腐剂带来不良口感。

  1、 材料与方法

  1.1、 实验材料及培养基

  大连金石滩海域捕捞的海参,冰盒保存带回实验室,立即取肠道内容物。试验采用MRS培养基。

  1.2、 仪器设备

  本研究用到的主要设备有梯度PCR (TC5000,英国TECHNE公司)、组织DNA快速制备仪(Fast Prep-1,美国MP公司)、超微量分光光度计(P-330-31,德国Implen公司)、电热恒温培养箱(DNP-9052,上海精宏)、高速冷冻离心机(S30262157,日本三洋)、显微镜(N300M中国永新)。

  1.2 、实验方法

  1.2.1 、乳酸菌的分离纯化

  取1.0g肠道内容物于MRS培养液中37℃静置富集24h。采用连续稀释法,取稀释倍数为10-5、10-6和10-7稀释液分别涂布于MRS固体分离培养基,37℃静置培养48h,挑去生长良好的菌落。部分菌苔放入过氧化氢溶液中,观察是否有气泡,筛选没有气泡的,即过氧化氢酶阴性的菌株进一步纯化[5]。

  1.2.2 、菌株的菌落形态、细胞特征和生理生化鉴定

  将纯化好的菌株,接种于MRS固体培养基上,静置培养48h,观察并记录其菌落特征,包括菌落边缘是否整齐、菌落颜色、大小、厚度、表面等形态学特征。然后根据《乳酸细菌的分类鉴定与实验方法》[6],进行了淀粉水解实验、精氨酸产氨试验、硫化氢的产生、乙酰甲基甲醇(V-P)、碳水化合物发酵产酸等生理生化试验。

  1.2.3、 16S r DNA分子生物学鉴定

  将乳酸菌HE04在固体培养基上培养48h,用竹签刮取少量菌体,放入灭菌小管里,微波法[7,8]提取菌体总DNA。用1%琼脂糖凝胶120V电泳30min,紫外观测台检测。
 

海参肠道中一株乳酸菌HE04的分离分析
 

  以将提取的基因组DNA作为模板,进行PCR扩增。采用通用引物F27和R1492,总体积50u L。PCR扩增条件为:95℃先预热变性4min,再进入30个循环,分别为95℃变性30s,55℃退火30s,72℃复性2min,最后72℃延伸10min。扩增产物1.5%琼脂糖凝胶120V电压下,电泳30min电泳,把凝胶放在紫外观测台上进行观察。

  2 、实验结果与分析

  2.1、 菌落特征及菌体形态观察

  从海参肠道分离得到13株过氧化氢酶阴性的疑似乳酸菌,经过三次纯化培养,最终筛选得到一株生长良好的菌株,命名为乳酸菌HE04,革兰氏染色后的显微镜下观察,革兰氏染色为阳性,细胞为杆状(见图1)。在MRS固体平板上培养48h后,菌落呈乳白色、表面光滑、易挑取、边缘园整、隆起、菌落直径小于0.5mm。

  图1 菌株HE04革兰氏染色
图1 菌株HE04革兰氏染色

  2.2 、乳酸菌的生理生化特征

  参照文献[6]中的方法,乳酸菌HE04做进一步生理学特征试验。结果显示过氧化氢酶阴性、精氨酸产氨实验、硫化氢的产生和V-P实验均为阴性;能水解淀粉、半乳糖、甘露糖、甘露醇、蔗糖、麦芽糖、乳糖、山梨醇、果糖和七叶苷,不能利用肌醇。(表1)

  图2 菌株HE04的16S r DNA的PCR产物电泳图2.3乳酸菌的分子生物学鉴定(16S r DNA)
图2 菌株HE04的16S r DNA的PCR产物电泳图2.3乳酸菌的分子生物学鉴定(16S r DNA)

  图3 菌株HE04与相似菌株的系统发育树分析
图3 菌株HE04与相似菌株的系统发育树分析

  表1 菌株HE04的生理生化结果
表1 菌株HE04的生理生化结果

  提取的总DNA在琼脂糖凝胶后的紫外观测台检测结果,可以看到条带清晰,满足下一步扩增要求。以提取的基因组DNA作为模板,进行PCR扩增,产物在1500 bp位置有清晰条带,说明PCR条件合理(图2),能够满足测序要求。

  16S r DNA的PCR扩增产物委托宝生物公司进行测序,测序序列结果上传到NCBI核酸数据库中,与已知的相关序列进行对比,从结果分析可知分离到的乳酸菌HE04的16Sr DNA序列与菌株Lactobacillus plantarum的16S r DNA序列的同源性最高(见图3),同源性达到100%。结合该菌株的的菌落形态和细胞形态特征、生理生化特征,乳酸菌HE04可鉴定为植物乳酸菌(Lactobacillus plantarum)。

  3、 结论

  本试验从海参肠道分离得到一株乳酸菌HE04。对乳酸菌进行菌落形态、细胞形态的观察,精氨酸产氨试验、糖发酵产酸试验、淀粉水解试验、V-P试验等生理生化试验,以及16S r DNA序列分析,最终鉴定其为植物乳杆菌。该菌株可以作为食品加工的种子资源。

  参考文献

  [1]王伟,丛丽娜,黄君,等海参肠道中乳酸菌的分离鉴定及活性物质研究[J].I业微生物,2018 ,48(04):24-29.
  [2]庞会利,谈重芳, 蔡义民,等.乳酸菌分类鉴定方法的研究进展[J].中国酿造,2009,6:1-5.
  [3]章志超,吴盘益生菌的功能特性及其在乳制品中的应用[J].现代食品,2018(03):7-10,15.
  [4]孟晓林,李文均,聂国兴鱼类肠道菌群影响因子研究进展[J].水学报产,2019,43(01):143-155.
  [5]刘长建徐洪涛,权春善等乳酸菌素生产菌的分离、鉴定[J] 食品与发酵I工业,2005,31(7):26-30.
  [6]凌代文乳酸菌分类鉴定及实验方法[M].北京:中国轻I工业出版社, 1998:117-128.
  [7]Orsini M, Romano V. A microwave-based method for nucleic acid isolation from environment samples[J.Letters in Applied Microbiology, 2001,33(1):17-20.
  [8]徐平,李文均,等微波法快速提取放线菌的基因组DNA[J].微生物学通报2003,30(4).82-84.

上一篇:发酵工艺对沙棘果醋食用参数的作用探讨
下一篇:没有了
重要提示:转载本站信息须注明来源:原创论文网,具体权责及声明请参阅网站声明。
阅读提示:请自行判断信息的真实性及观点的正误,本站概不负责。