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组培微枝试管外生根的影响因素及其运用

来源:原创论文网 添加时间:2020-06-12

  摘    要: 介绍了植物组培微枝试管外生根技术的概念,生根环节及技术要求、影响因素、试管外生根的优势及国内外应用情况,为植物试管外生根技术的应用及推广提供参考。

  关键词: 组织培养; 微枝; 试管外生根;

  Abstract: In this paper,ex-vitro rooting technology of micro-cuttings and some related factors were introduced,which included the concept,the processes and the technical requirements,the influencing factors,the advantages,and the application of this technology. The paper will provide references for the application and promotion of plant ex-vitro rooting technology.

  Keyword: Tissue culture; Micro-cuttings; Ex-vitro rooting;

  随着国内外植物离体快速繁殖研究的飞速发展,组培技术已经成为商业化育苗的重要手段,得到了广泛应用,其过程主要包括:诱导茎芽(shoots或micro-cuttings)发生、增殖增壮、诱导生根、驯化移栽和成苗培育。这一过程中,每个环节的成败都将决定能否实现产业化微繁。但是,其中的生根诱导和驯化培育是育苗程序中的关键技术环节,它将关系到离体快繁生产苗木的成活率、根系发育、苗木发育和健壮程度、无性系增益,以及苗木培育成本等诸多问题。因此,如何提高组培微枝生根和移栽成活率就成为工厂化育苗生产中的重中之重。

  在组培体系建立过程中,存在部分植物试管内生根困难、根系发育不好、移栽成活率低等问题,同时为了缩短育苗生产周期、降低培养成本,在原有生根和驯化程序的基础上进行了改进。1988年英国格拉斯哥植物园秋海棠中心通过对秋海棠叶进行离体繁殖,成功建立了试管外生根技术——体外生根和驯化一步完成的先例,自此组培微枝生根诱导的途径可以主要分为试管内生根和试管外生根两种。随着植物组织培养技术在苗木繁殖中迅速发展,试管外生根技术作为一项先进的生根诱导技术也被广泛应用于商业化组织培养的生产实践中[1]。
 

组培微枝试管外生根的影响因素及其运用
 

  1、 组培微枝试管外生根技术

  试管外生根技术是将组培茎芽的生根诱导同驯化培养两个过程合二为一,直接将茎芽扦插到试管外有菌环境中,在诱导生根的同时进行驯化培养。经过此过程诱导所产生的根均为不定根。

  依据不定根发生原理,试管外生根技术是人为地调控温度、湿度、光照等环境因子,诱导并促进组培茎芽产生不定根,在移栽基质中不断长出新根,吸收营养,进而供整个植株生长、发育,直到长成一棵正常健壮的植株。

  微枝试管外生根的方法很多,有基质培养、水培养、气雾培养和滤纸桥法等。其中,基质培养法是试管外生根的主要培养方法,应用最广,其他方法应用较少[2,3,4,5,6,7]。以基质培养方法为基础的木本植物组培茎芽试管外生根技术,主要包括5个环节,各环节技术要求如下:①茎芽增壮和移栽前的预处理技术。包括试管内茎芽稳定化保存、扩繁、增壮以及试管外生根前的处理和驯化等技术。该阶段一般将茎芽先用50~200 μg/mL的IBA溶液快速浸蘸,或在含生长素的琼脂培养基或液体培养基上处理微枝5~10 d后,或不经任何处理,直接扦插到生根基质上诱导生根。扦插时注意保持微枝的水分平衡,不断用蒸馏水喷洒微枝。②茎芽试管外生根基质的调控技术。包括生根基质的组成调控、pH调控、湿度控制、污染控制等相关技术。茎芽试管外生根基质可以是腐殖质土(或草炭土)、珍珠岩、细砂、蛭石、椰糠等,按一定比例配制,有时可用1/2MS添加IAA或IBA(1~5 mg/L)所组成的营养液加入基质内;扦插后要用灭菌剂浇灌生根基质,一是灭菌,二是替代灌水。生根基质一般经过试验被证明有效即可,可装在塑料钵、盆、瓶或木盆、塑料育苗筐内,也可置于苗床上。③茎芽试管外生根微环境控制技术。包括在小型试管外生根容器如塑料盒内微环境控制、温室内塑料小棚微环境控制、雾室等技术。茎芽试管外生根微环境,湿度通常采用塑料薄膜先密封后逐步透气或间歇喷雾的方式维持,一般要保持在80%以上,环境温度及生根持续时间视植物种类而异。④茎芽试管外生根营养管理技术包括试管茎芽移栽到试管外环境下分阶段水分和营养调控等管理技术,具体措施根据不同物种而定。其中水分的管理控制较为严格,水分过少可造成茎芽干枯,过多会造成芽苗腐烂。营养液配方是指在不同发育阶段根据植株生长需求而设计的平衡配方[8]。为使植株生长达到最佳状态,水肥管理要采取交替供应,科学合理地供给植株,协调好二者次数、供应间隔时间、施用量,进而保证基质营养和水分平衡。⑤生根组培小苗野外移栽培养技术。包括试管外生根苗的移栽技术、野外环境下分阶段水分调控技术、养分营养管理技术和病虫害防治管理技术等,具体措施根据不同物种而异。

  2、 组培微枝试管外生根的影响因素

  影响组培微枝试管外生根的因素很多,也较为复杂,主要可分为内因、外因和综合因素。

  2.1、 内因

  2.1.1、 植物物种本身的特性。

  通常影响植物试管外生根的主要内因有物种、基因型、幼化程度等。与草本植物相比,木本植物较难生根,而杨柳等较其他树种易生根,扦插后成活率很高,而月季、苹果、胡桃、桃、花椒等较不易生根。有研究表明,5个不同的刺槐无性系之间试管苗生根率有显着差异[9]。

  2.1.2、 苗木质量。

  组培苗的生长状况是影响微枝试管外生根的另一内因。一般继代多次后,出瓶前至少要经过一次壮苗培养,以保证微枝半木质化状态,提高苗木质量从而获得较高生根率。

  除此以外,提高苗木质量的途径还需要在微枝出瓶前进行炼苗培养。试验证明,瓶外生根率比瓶内生根率略低[10]。通常将无菌茎芽在较强的光照下闭瓶炼苗3~4 d,以促使试管内的无菌芽由异养变为自养。健壮的无菌茎芽,微枝扦插后易生根和成活;反之,弱芽、黄化芽、老化芽及玻璃化芽则扦插不易生根或扦插成活率较低[11,12]。

  2.2、 外因

  2.2.1 、移栽基质。

  2.2.1.1、 试管外生根常用基质。

  基质一方面起固定和支持微枝的作用,另一方面可以提供更适宜的生根环境。常用基质中,泥炭或草炭土吸水性好,透气性较好,酸性较强,pH为3.5~5.0;蛭石有高的水分保储能力和阳离子交换能力,pH为6.0~7.6;珍珠岩具有封闭的细胞结构,排水性好,质量小,坚硬不易压缩,被添加到泥炭藓基质中可增加气体的孔隙,pH为6.0~8.0;河沙吸水透气性均较好,偏碱性[13]。

  微体扦插选择基质时要基于疏松透气、排水良好又保湿保温的原则。通常宜采用包括苔藓、蛭石、珍珠岩、泥炭、粗沙等其中的一种,或者将它们按一定的比例混合。试管外生根时具体使用什么基质需根据物种本身的特性和实践经验来定,一般情况是两种或几种基质混合使用效果较单一基质要好[11,12,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24]。

  2.2.1.2、 试管外生根基质使用前的消毒处理。

  基质在试管外生根使用前要进行消毒处理(包括蒸气消毒或药剂消毒)[25]。采用高压灭菌、药剂灭菌(菌虫双杀)、对照(不灭菌)3种处理对某一引进杨树试验时发现高压灭菌生根率最低,且基质表面容易滋生霉菌,药剂和对照差别不显着。因此,高温高压灭菌虽然比较彻底,但一些有益菌也会受到损失,而生根过程并不是无菌环境,可使杂菌滋生速度加快,有益菌可有效抑制杂菌生长。

  2.2.1.3、 试管外生根基质的pH。

  基质pH是其重要属性之一,可影响养分存在、状态,转化和有效性,对植物生长发育有直接影响[26,27]。例如杜鹃喜欢酸性环境(pH为5.0~5.4),这是因为培养基的酸碱度可显着影响试管苗根系的生长[28]。

  2.2.1.4、 试管外生根基质含水量。

  根系是陆生植物吸水的主要器官,可从土壤中吸收大量水分,满足植物体需要。土壤水分过多或过少都会对根生长有害[17]。其中基质含水量是影响试管外生根的另一个重要因素,因此茎芽扦插基质一般采用既透气又保湿的基质条件[18,19]。

  2.2.2、 环境条件。

  温度、湿度和光照条件是决定试管外生根能否成功的关键因素。林艳等[29]对切花月季微枝扦插生根的主要环境因素进行研究,发现环境因素排序为温度>基质水分和湿度>光照,四者的平衡是获得较高生根率的保证。

  2.2.2.1、 温度。

  目前,有关温度对茎芽试管外生根的影响研究较少,一般认为在20~30 ℃均可生根并满足生长。在不定根发生和根部吸收矿质元素方面存在两个最适温度,地下部分和地上部分对温度的反应也存在差别,同时较大的昼夜温差也有利于生根。

  微枝扦插后一般温度起始阶段需要控制在20 ℃左右[30,31]。李静[32]通过研究火鹤、红宝石、喜林芋、花叶绿萝等几种观赏植物的快繁分化和生根的影响发现,试管苗移栽驯化阶段,只有在基质温度达15 ℃时试管苗才能正常生长。

  2.2.2.2 、湿度。

  湿度对茎芽试管外生根过程也有着决定性影响,主要分两方面:土壤湿度和空气湿度。一般说的湿度是指空气湿度,空气湿度过高加之温度高会引起扦插苗叶腐烂,同时也会引起杂菌滋生;而湿度过低,扦插苗易萎蔫失水。土壤湿度对生根影响也非常重要,一般湿度控制在85%以上可满足苗木生根[20]。另外,研究发现保湿天数对生根成活率也有影响[29]。

  2.2.2.3、 光照。

  光照对实生苗影响较大,直接外在表现为幼苗质量、形态和控制幼苗休眠等,而对组培苗试管外生根这一过程影响较小,但对其生根后的影响和实生苗相同。在室内进行生根可采用日光灯,且环境中的温度不易升高。光强、光质、光周期这三个方面对试管外生根的影响有待于进一步研究和摸索,从而掌握好有利于茎芽试管外生根和生长的光照条件。

  2.2.3 、外源激素及生根促进剂等。

  2.2.3.1、 生长素。

  在植物组培过程中生长素是促进不定根形成的主要激素。大量的研究表明,生长素在根原基的启动和形成阶段起关键作用[33,34]。通常,在根形成过程中,起始于茎内已分化的潜伏根原基,只要条件适宜,即可被激活并分化形成不定根[29,35]。

  生长素促进生根与其种类和施用浓度有关。多数研究认为,IBA是比NAA生根作用更有效的一类生长素,这是因为NAA能促进插条贮存的淀粉水解为还原糖,为根的形成提供较为丰富的能源和碳源,从而促进插条萌生,而IBA对根原基产生也有促进作用[23,36,37,38]。

  此外,生长素的作用与处理时间有关。经IBA处理21 h的布克荚蒾生根率及根长和生根条数都是最佳的,显着高于其他处理;而0.5 h处理时生根率出现反弹,但是根长和生根条数较低[39];范志强等[21]在黄金槐生根中也发现不同生长素与不同浓度对成活率均有较大影响,同一生长素同一浓度的不同时间处理,成活率也有较大差别。

  2.2.3.2、 赤霉素、脱落酸、水杨酸和茉莉酸。

  赤霉素对不定根的形成有促进和抑制两个方面的作用,一般来说,低浓度的脱落酸(ABA)可促进杨树生根,高浓度的则会抑制;低浓度的水杨酸(SA)可促进绿豆去根芽的不定根形成;10~100 mg/L SA 可抑制绿豆插条不定根形成;用茉莉酸甲酯(MeJA)溶液(10-5~10-3 mol/L)处理绿豆下胚轴插条基部的不定根数目显着增加[40]。但有关这些激素在试管外生根中的应用还鲜见报道。

  2.2.3.3、 生根粉。

  ABT生根粉是中国林业科学研究院林业所1983年研制成功的广谱生根剂,是一种广谱、高效、复合型的植物生长调节剂。它被广泛应用在植物试管外生根生产中,价格低廉且效果显着[41,42,43,44,45]。

  2.2.4、 人为因素。

  影响试管外生根的因素有很多,部分可调控,部分不可调控。微枝扦插小苗所处的环境与组培苗相比,孤立性和封闭性较低,而微小的环境变化也可导致试管外生根环境的变化,进而影响生根状态。这就要求工作人员要极其细致地按照规程进行操作、观察并定时对微环境进行监测。

  2.3 、综合因素

  影响试管外生根的各因子不是完全独立的。如高温或高湿均有利于生根,但二者同时高或者仅有一个因素高都不利于生根,通常交互作用影响生根效果。此外,湿度和光照间也存在交互作用。

  3、 组培微枝试管外生根技术的优点

  试管外生根技术的关键是将生根诱导和驯化培养两过程合二为一,从而省去了组培苗试管内生根的传统程序。该技术的应用不仅可以简化育苗程序,而且可降低生产成本[46,47,48]。这是因为组培苗试管外生根具有诸多优点。

  3.1、 根系发达、苗木生长状态良好

  利用试管外进行生根的苗木主要表现为木质化程度高、中柱发育早,根毛较多,利于根系建成;分生能力强、生长速度快,茎干皮层细胞个体较小、液泡小;叶片角质层发达(试管内生根苗蜡层仅为试管外生根苗的35%),叶片皮孔开张角度小,气孔内陷(试管内苗外凸),抗蒸腾能力和适应能力强,海绵组织和栅栏组织分化程度高,叶肉细胞叶绿素含量高、光合能力强等[10]。

  3.2、 移栽成活率高

  检验组培是否成功最关键的指标是移栽成活率,也是决定组培能否从实验室阶段转化为规模化生产的关键。综合国内外研究结果,组培茎芽试管外生根的移栽成活率显着高于试管内生根的成活率。这是因为茎芽试管外生根过程已逐步适应了自然环境,经过锻炼成活的小苗表现的抗逆性较强,易于成活,移栽成活率高。

  3.3 、有效降低育苗成本

  国外学者Debergh[49]认为诱导组培苗试管内生根的成本占整个微繁成本的35%~75%;有研究证实[10]采取试管外生根可减少这部分费用的70%(表1)。

  表1 试管内/外生根育苗成本比较

  表1 试管内/外生根育苗成本比较

  需要注意和指出的是试管外生根不是万能的,对于难生根植物,试管内生根还是必要的选择。

  4、组培微枝试管外生根技术的应用

  组培微繁试管外生根的尝试和研究始于20世纪80年代中期,国外先于国内,经过10年的发展逐步成熟,尤其美国的商业化组培苗木生产,几乎均采用试管外生根技术且较为成熟。利用强大检索功能的CAB文摘库,发现在检索到的从1973—2019年发表的组织培养文献中,有关试管外生根技术的文献有4 000多篇,在网上也可以直接搜索到许多相关研究或文献介绍。这些文献涉及草莓、苹果、樱桃、李子、胡杨、洋白蜡、美国白蜡、银槭、茶树、桉树、番木瓜、黑豆果、北美稠李、红樱桃、番樱桃、黑胡桃、杜鹃、丁香、白桦、榛子、山核桃、栎树、椴树,以及一些药用植物、芳香植物等许多植物种类的试管外生根技术。

  20世纪90年代以来,随着组培商业化育苗的发展,国内开展了组培苗试管外生根的解剖学观察[30,33]、试管外生根的影响因素以及技术方法的研究,并且将其应用于生产,取得了一定的成绩。目前我国仍以试管内生根诱导为主,效果差,成本高,而试管外生根尚处于起始阶段,部分物种可以通过组培试管外生根进行大量的苗木繁育,但大部分物种还远未形成成熟的技术体系。目前,已经先后在狗头枣[23]、切花月季[29]、金线莲[11]、一品红[12]、牡丹[35]、三倍体毛白杨[50]、黄金槐[51]、杂种酸模[52]、无花果[53]、84K杨树[54]、美国红栌[55]、葡萄[56]、香果树[57]、奥地利黑松[58]、罗汉果[59]、红叶石楠[60]、非洲堇[6,7]、蓝莓[61]、欧美山杨杂种[62]、草莓[63]和栝楼[64]等植物上进行了初步研究和应用。

  笔者所在研究组曾得到国家林业局“948” 引进项目“组织培养茎芽试管外生根技术的引进”资金的支持,并从国外引进颤杨、杜鹃、欧洲丁香、紫叶白桦优良组培系。首先利用引进的试管外生根技术,并采用最佳组培系对这些品系进行了扩繁;同时针对几个乡土树种如花楸、新疆杨、丁香(紫丁香、暴马丁香和黄叶丁香等)和风箱果等也进行了尝试研究,并建立了相应的试管外生根技术体系;同时对相关技术进行了技术示范和推广应用。

  试管外生根是组培商业化育苗中一项具有很大发展潜力的实用技术。随着苗木商品化和育苗设施的发展,尤其是计算机微域环境控制技术以及现代物理、化学调控技术的发展和温室管理技术的进步,采用环控大棚进行试管苗瓶外生根育苗以及推行瓶外生根标准化生产将成为未来试管苗瓶外生根的发展趋势。

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