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保存微藻藻种的主要技术探究

来源:原创论文网 添加时间:2021-10-08

  摘    要: 微藻因其优良的理化性质及代谢产物的多样性,可广泛应用于化工、医药、食品、环境监测等领域。高效利用微藻资源的前提是在微藻培养过程中保证微藻藻种的活性及遗传稳定性,这就使得微藻藻种的保存技术显得尤为重要。文章综述了几种常见保存藻种的方法,包括继代法、固定化技术、超低温保存技术、冷冻真空干燥技术及浓缩液保存技术,并针对每种保种技术的研究现状、技术特点及其发展方向进行了详细的分析,旨在为微藻藻种的保存研究提供参考价值。

  关键词 :     微藻;种质资源;继代法;固定化技术;超低温保存技术;浓缩液保存技术;

  Abstract: Due to its excellent physical and chemical properties and the diversity of metabolites, microalgae can be widely used in chemical, pharmaceutical, food, environmental monitoring and other fields. The prerequisite for efficient use of microalgae resources is to ensure the activity and stable heredity of microalgae species during the process of microalgae cultivation, which makes the preservation technology of microalgae species particularly important. This article reviews several common methods for preservation of microalgae species, focusing on several common methods for preservation of algae species, including sub-generation method, immobilization technology, ultra-low temperature preservation technology, freeze-vacuum drying technology and concentrated solution preservation technology. The research status, technical characteristics and development direction of each kind of conservation technology were analyzed in detail, aiming to provide reference value for the conservation research of microalgae species.

  Keyword: microalgae; germplasm resources; succession method; immobilization technolog; cryopreservation technology; concentrate preservation technology;

  1、 引言

  微藻作为一种绿色藻类微生物,新陈代谢快,通过光合作用可以吸收二氧化碳,其代谢产物具有广泛利用价值,可用于能源开发(生产生物质能源,包括生物柴油,生物燃料乙醇等)、药物研制(如一些海洋微藻富含EPA和DHA,可用于心脑血管疾病方面)、污水净化、水产养殖等方面[1,2,3]。微藻的保存技术是微藻整个培养过程中十分重要的一个环节,对后续微藻能否成功培养及应用至关重要。因微藻藻种容易染菌,且藻种的分离步骤繁琐、耗时长,筛选获取一株有应用价值的藻种更是不易,所以在微藻的保存过程中,要尽量使得接种次数更少,避免藻种染杂菌,达到延长转接间隔时间,长期保存藻种的目的,同时可以维持藻种优良的遗传特性及生命活性,简化传代操作的程序,降低藻种的变种率,以培育优质的微藻株系,利于科学研究及工业应用[4,5]。

  本文综述了几种常见保存藻种的方法,包括继代法、固定化技术、超低温保存技术、冷冻真空干燥技术及浓缩液保存技术,并针对每种保种技术的研究现状,技术特点及其发展方向进行了详细的分析,旨在为微藻藻种的保存研究提供一定参考价值。
 

保存微藻藻种的主要技术探究
 

  2、 微藻藻种保存技术

  2.1、 继代法保存技术

  继代法是当前比较通用的保种技术,是将藻种接种在单一的固体、液体或双相培养基上,在适宜的光照和温度下培养,待藻种生长状态良好后,将其移至常温或低温及弱光下保存。一般一次转接藻种可保存几个月到一年,然后进行再次转接,该保存方法可适用于一切藻类。海洋单细胞藻液用硫酸庆大霉素处理后,再转接至固体培养基上,然后选出生长状态优良的固体培养基放置于5~10℃的低温培养箱中自然光照,可发现其藻种可保存1~2年[6]。金藻、角毛藻等藻种采用固体培养基保存技术,藻种在1℃的低温培养箱中可保存2~3年左右[7]。研究表明,采用继代保存法和固定化保存法保存雨生红球藻,从复苏后的存活率、相对生长速率等方面发现,液体保存优于固液双相保存和固定化保存,液体保存的存活率在九成以上,而固定化保存则比较适合长时期的藻种保存[8]。液体保存易于操作,但保存时间短,固体保存时间长但容易干涸,双相培养可兼具两者的优点,保存效果好于采用单种培养基培养[9]。继代法是实验室中保存藻种的常见方法,简单易行,设备简单,但工作琐碎,耗时较长,需要频繁的转接藻种,易造成藻种的染菌或使藻种老化,丧失活性。

  2.2、 固定化保存技术

  固定化保存技术是一种最接近藻种原始状态下的培养方法,是指将游离细胞包埋在多糖或多聚化合物形成的网状结构中,在无菌环境下培养,因为固定载体的存在,藻种的代谢过程受到束缚,从而减缓了细胞生长分裂的速度,导致微藻生长速度减缓,其固定化时间随微藻的种类而变化。微藻的固定化技术包括吸附法、包埋法和交联法三种,分别通过不同的作用力和作用方式与微藻结合,其中包埋法因使用方法简单,基本不会影响微藻藻种的生物活性,颗粒强度高等优点,是当下应用最为广泛的微藻固定方法[10,11,12]。CN103740692A[13]介绍了一种极地雪藻固定化保种的方法,采用蛋白胨代替传统的褐藻酸钠做固定剂,采用乙二醇做抗冻剂,将接种后的培养基置于-50±2℃的温度下保存,可大大提高藻细胞的生命活力,存活率高达92%,且延长了藻种保存的时间。固定化保存培养保存技术对大部分藻种是适用的,有的藻种的保种时间可达2年左右,并且藻种的保存时间较长,活化复苏也较快[14]。

  采用固定化保存结合其它保存方法,可以提高保存质量,将固定化保存与干燥保存相结合,在有甘油做保护剂的情况下,采用包埋-脱水法保存绿色巴夫藻,低温下藻种的存活率高,且藻种复苏后,其活性与保存前相当[15]。研究表明,用包埋脱水法探究了牟式角刺藻的超低温保存,考察了影响微藻存活率的内外因素,发现藻细胞包埋在含有0.5 mol/L蔗糖的3%褐藻酸钙胶球中,以平均速率0.9%含水量/h脱水至胶球含水量为40%的条件下冷冻存活率较高,可达到30%左右[16]。包埋-脱水法和常用的两步法冰冻保存对比,其操作方式更为简单。固定化保存技术于多数藻种是适用的,且保存时间相对较长,可在常温或中低温下实现对藻种的中期保存,且活化复苏很快,设备简单,但固定化步骤较多,对操作要求高,在培养后阶段,多数藻种容易从胶珠中溢出,有的胶珠甚至会融解。且不同藻种对某一固定化保种技术会有不同的适应状态,原因和机制都不明确,尚待深入研究,这是以后该技术发展的难点之一。

  2.3、 超低温保存技术

  超低温保存是指在低共熔点(-135~139℃)以下的温度保存材料,通常使用液氮(-196℃)作为冷媒,此时生物体的代谢及生长过程几乎完全终止,但处于可逆成活的状态,是一种能够长期保持生物遗传稳定性的技术,也是目前保存活体生物材料最为有效的方法[17]。此过程需要使用抗冻保护剂,防止细胞在降温冷冻过程中脱水严重和胞内形成冰晶。当下比较通用的是采用两步法进行超低温保存,第一步是在微藻中添加抗冻保护剂(如甘油、DMSO、甲醇等),然后在一定低温下对保存微藻进行预冻,第二步是将预冻过的微藻置于液氮中快速冷冻。与一步法相比,两步法能有效较少细胞在冷冻过程中产生的危害,提高微藻复活后的存活率,但仍需对藻种保存的时机、保护剂的类型及用量、解冻的程序等进行全面细致的考察,以提高藻种存活率[18,19]。

  超低温保存技术可长期保存藻种,最大限度地减少染菌的可能性,但也存在着复杂的预冷冻程序,费用高,耗时长,且不能避免冻融过程中晶体的形成,对保存的藻种造成了损害。超低温保存藻种的基础上,研究者们又提出了包埋-脱水冷冻保存和玻璃化冷冻保存两种技术。采用包埋-玻璃化法冷冻保存藻种,其实验操作方法简单,存活率较高,藻种保存效果较好,藻种进行玻璃化冻存,可以筛选出品质优良的藻种,存活下来的藻种经过复苏后具有更好的活性、产率及抗冻性[20,21,22]。林小园等[23]提出玻璃化保存技术是目前长期稳定保存海洋种质资源最理想的方法,指出玻璃化抗冻剂组合的选择及浓度、冷冻保存升降温速率等是玻璃化保存技术中重点关注的技术问题。超低温保存技术是当前唯一不需要继代培养长期保存微藻类资源的方法,其研究技术也在不断创新和发展中取得了一些进展,但仍存在着缺少普适的各类微藻保存冷冻程序、缺少能进行超低温长期保存的微藻保存中心等问题。

  2.4 、浓缩低温保存技术

  微藻的浓缩低温保存技术是用物理或化学的方法将培养的藻液浓缩为藻泥或藻膏,再低温保存;该方法多用于海洋微藻。海洋微藻的浓缩低温保存方法源于上世纪80年代,并获得了许多研究成果,如美国、日本等已有相关的微藻浓缩细胞(也可称为“藻膏”)产品在市面上销售。研究表明,小新月菱形藻、球等鞭金藻采用浓缩超低温保存技术,浓缩藻液在1~4℃的低温下添加保护剂(SAM)可以保存3个月,再次复苏后其活性较好。对等鞭金藻在0~10℃的低温下长期保存后,其存活率较高,可达70%以上,且在复活生长时维持较高的比生长速率[24,25]。三角褐指藻采用浓缩超低温保存技术,最适的保存温度为0~10℃。眼点拟微球藻采用浓缩超低温保存技术,保存温度在-18℃下,在不添加任何保护剂下可保存3个月,且细胞活性高[26]。

  浓缩低温保种技术可简单高效的保存藻种,但保存时间较短,也存在着一些尚待考察的问题,如每一种藻类最适的化学浓缩剂及剂量不能确定,不同化学浓缩剂和冷冻保护剂的毒性除去方法需要进一步的研究等。超滤膜法浓缩微藻具有较好的发展前景,该方法不毒害藻类、成本低、效率高,但相关技术对细胞作用的细节需要更深层次的研究。

  2.5、 真空冷冻干燥保存技术

  真空冷冻干燥保技术是将藻种在极低的温度下(-70℃左右)快速冻结,然后用真空技术将微藻中的水分抽干,让藻种的新陈代谢活动介乎高度静止状态[27]。相对于普通直接干燥脱水和硅胶吸附脱水,真空冷冻干燥保存最大限度的避免了对细胞的直接伤害,并使细胞在较温和的条件下处于干燥和缺氧状态,从而使微生物的代谢活动处于休眠状态,生长繁殖受到抑制[28]。一般而言,微藻干燥保存的机理主要分为两种,一种是抗氧化酶系统的作用,能够抵御细胞脱水所引起的氧化伤害[29],另外一种就是糖类的作用,减少细胞在脱水过程中引发的质膜破坏效应[30]。

  真空冷冻干燥保存技术被公认为是迄今最佳的藻种保存方法。该方法主要集中用在蓝藻和绿藻中。用脱脂乳、蜂蜜等做保护剂,将藻液置于安瓿管中,冷冻、干燥并抽真空,火焰熔封,放置低温避光处保存,可保存十几年。冷冻干燥保存法的优点保存期内可防止其他杂菌污染,运输方便,解冻后微藻能保持活性,适合在工业化生产中使用,有广泛的应用领域;其缺点是使用方式过于复杂、对仪器的性能要求高等。

  3 、结论和展望

  随着石化能源储量的不断减少、环境污染问题的日趋严重及生物质能源的日益兴起,研究和开发微藻种质资源等生物质能源是具有战略意义的,同时具备较高的经济、社会和生态价值,再加上中国自身拥有丰富的藻类资源,收集和保存各类优质种质就变得尤为重要。微藻的藻种保存技术尚未发展成为一项成熟稳定的技术,还有诸多问题等待去解决,如各种保存方法均未建立完整的保存体系和标准,其中一些细节性的问题和机理,如冷冻保存过程中保护剂类型和用量、细胞抗冻机理等都有待进一步的研究。开展微藻藻种保存技术方面的工作,不但会填补微藻藻种保存技术理论研究上的空白,而且有利于指导工业化生产,这就需要对其进行细致详尽的研究,建立起一整套藻种种质资源保存方案。

  参考文献

  [1] Sheehan N P.Ng A,Murray K,et al. Bioenergy from biofuel residues and waste[J] Water Environment Research,2020,92(10):1082-1090.
  [2] Khoo K S,Wen Y C ,Chew K W,et al.Microalgal-bacterial consortia as future prospect in wastewater bioremediation, environmental management and bioenergy production[J]Indian Journal of Microbiology,2021,48(8):942-948 .
  [3] Habeeb Z,Lewis R,Liu S M,et al. Qualitative and quantitative assessment of biodiesel derived from microalgae[J].Journal of Chemical Education,2020.97(10):3791-3796.
  [4] Ashtiani F R,Jalili H,Jahromi M R,et al. Effect of mixed culture of yeast and microalgae on acetyl-Co A carboxylase and Glycerol-3-phosphate acyltransferase expression[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2021,131(4):1518-1526.
  [5]Wendt L M.Kinchin C,Wahlen B D,et al.Assessing the stability and techno-economic implications for wet storage of harvested microalgae to manage seasonal variabiliy[J] .Biotechnology for Biofuels,2019, 12(1):209-213.
  [6]Zhang W J,Wu L F.Flagella and swiming behavior of marine magnetotactic bacteria[J] Biomolecules,2020,10(3):10-15.
  [7]Pelusi A,Santelia M E ,Benevenuto G,et al.The diatom Chaetoceros socials:spore formation and preservation[J].European Journal of Phycology,2019,8(2)-1-10 .
  [8]Fang L,Zhang J,Fei Z,et al.Astaxanthin accumulation difference between non-motile cells and akinetes of Haematococcus pluvialis was affected by pyruvate metabolism[J]Bioresources and Bioprocessing,2020,7(1):1-12 .
  [9]Dbowski M,Zieliski M,Kisielewska M,et al.The cultivation of lipid-rich microalgae biomass as anaerobic digestate valorization technology-a pilot-scale study[J].Processes,2020,8(5):517-522 .
  [10] Cao S,Teng F,Wang T,et al. Characteristics of an immobilized microalgae membrane bioreactor (i MBR);.Nutrient removal,microalgae growth, and membrane fouling under continuous operation[J] Algal Research,2020,51(2):1020-1027.
  [11]Bernard A.Barreneche T,Donkpegan A.et al. Comparison of structure analyses and core collections for the management of walnut genetic resources[J]. Tree Genetics&Genomes,2020,16(5):31-36.
  [12]Yin F, Sun X,Zheng W,et al.mproving the quality of microalgae DHA-rich oil in the deodorization process using deoxygenated steam[J].Journal of Food Processing and Preservation,2020,44(8):739-746.
  [13]王培磊,王博仑. 极地雪藻固定化保种方法: CN 103740692 A[P].2014-04-23.
  [14]Lobakova E S,Vasilieva S G, Shibzukhova K A,et al.mmobilization of cyanobacteria and microalgae on polyethylenimine-based sorbents[]. Microbiology.2017,86(5):629-639
  [15]Sun L,Chu J,Sun Z,et al.Physicochemical properties,immunomodulation and antitumor activities of polysaccharide from Pavlova viridis[J].Life Sciences,2016, 144:156-161.
  [16]Foster R A,Goebel N L,Zehr J P.Isolation of calothrix thizosoleniae(cyanobacteria) strain sc01 from chaetoceros (aillariophyta) spp .Diatoms of the subtropical north pacificocean[J]. Journal of Phycology,.2010,46(5): 1028-1037.
  [17]Claudia,Ruta, Giuseppe,et al.Long-term preservation of Cicer arietinum L germplasm by in vitro propagation and cryopreservation[J]. Genetic Resources and Crop Evolution,2020,67(2):263-271。
  [18] Takahashi N,Harada M,Oi N,et al.Preclinical validation of the new vitrification device possessing a feature of absorbing excess vitrification solution for the cryopreservation ofhuman embryos[J] Journal of Obstetrics and Gynaecology Research,2020,46(2)-.451-458 .
  [19]Maria Portia,Nagata B,Junki,et al. Bovine sperm selection procedure prior to cryopreservation for improvement of post-thawed semen quality and fertility[J]. Journal of AnimalScience and Biotechnology,2020,11(01):48-61 .
  [20]Boroda A V,Aizdaicher N A,Odintsova N A.The influence of ultra-low temperatures on marine microalgal cels[J]Journal of Applied Phycology,2014,26(1):387-397 .
  [21]Kyoya T.Nakamura Y,Miyatani S,et al. Evaluation of oxygen consumption in human vitified and warmed pre-antral fllicles after prolonged low temperatures[J].Reproductive Medicine&Biology,2014, 13(1):21-29.
  [22]Kasai M,Mukaida T.Cryopreservation of animal and human embryos by vtitin[J.Reproductive Biomedicine Online,2004,9(2): 164-170.
  [23]林小园,刘红全,袁卫生.海洋微藻的玻璃化冻存技术研究进展[J] .江苏农业科学, 2014,42(1):190-193.
  [24] Poljaroen J,Vanichviriyakit R, Tinikul Y,et al. Spermatogenesis and distinctive mature sperm in the giant freshwater prawn,Macrobrachium rosenbergi (De Man, 1879)[J]. Zoologischer Anzeiger-A Journal of Comparative Zoology,2010,249(2):81-94.
  [25]Emilie H,Fabrice L,Melilotus T,et al. Spectral fluorometric characteriz ation of haptophyte dynamics using the fluoroprobe.an application in the eastern english channel for monitoring phaeocystis globosa[]. Journal of Plankton Research,2012,34(2):136-151 .
  [26]Keim L, Sptl C ,Brandner R.The aftermath of the carnian carbonate platform demise:a basinal perspective (dolomites southermn alps)[J] Sedimentology.2010,53(2):361-386.
  [27] Yin F,Sun X,Zheng W,et al.mproving the quality of microalgae DHA-rich oil in the deodorization process using deoxygenated steam[J] Journal of Food Processing and Preservation,2020,44(8).252-253.
  [28] Wenzel T,Gieseler M,Gieseler H.Design of vacuum-induced freezing protocols for high fll volume formulations in freeze-drying:a strategic approach[J].Journal of Pharmaceutical Sciences,2020,109(10):1579-1588.
  [29] Park J H,Lee S I,Kim | H.Effect of dietary Spirulina (Arthrospira)platensis on the growth performance, antioxidant enzyme activity.nutrient digestilty.cecal microflora,excretanoxious gas emission,and breast meat quality of broiler chickens[J] Poult,2018,27(1):123-128。
  [30]Wu S,Cao G,Adil M F,et al.Changes in water loss and cell wall metabolism during postharvest withering of tobacco (Nicotiana tabacum L )leaves using tandem mass tag-based quantitative proteomics approach[J] Plant Physiology and Biochemistry,2020, 150(6):121-132.

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